Возраст-ассоциированные эпигенетические изменения, их взаимосвязь с другими процессами, лежащими в основе старения. Эпигенетические часы как биомаркер старения.

Если геном — это аппаратное обеспечение (“железо”) организма, то эпигеном является его операционной системой, регулирующей экспрессию тех или иных генов. Здесь речь идет в частности о структурных модификациях, обусловленных химическими изменениями, т.к. экспрессия того или иного гена зависит от упаковки ДНК и её доступности для транскрипции (РНК) и трансляции (белок). Геном эукариотов компактно упакован в ядре клетки – ДНК намотана на нуклеосомы, состоящие из белков под названием гистоны. Модификации гистонов изменяют структуру нуклеосом, а, значит, и упаковку ДНК, делая последнюю более или менее доступной для транскрипции. От того, какие гены экспрессируются в той или иной клетке зависит их тип, поэтому, в одном и том же организме, скажем, эритроциты, так сильно отличаются от нейронов, несмотря на то, что ДНК в них упакована одинаковая. Важной задачей молекулярной биологии является понимание, какие внутренние и внешние факторы влияют на дифференцирование клеток и их финальную приверженность к тому или иному типу. Революционным стало открытие лаборатории Шиньи Яманаки, показавшее, что применение всего четырех транскрипционных факторов Oct-4, Sox2, Klf4, и c-Myc, теперь известных как факторы Яманаки, может перепрограммировать соматические клетки (фибробласты) в плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs). При дальнейшем же воздействии на них определенными факторов возможно получить клетки любого типа. О том, как это открытие используется в контексте омоложения клеток мы расскажем чуть позже, а пока краткая справка об эпигенетической регуляции и её изменении с возрастом.  

Основными процессами эпигенетической регуляции (т.е. контролирующей экспрессию генов), являются 1) метилирование ДНК 2) посттрансляционные модификации гистонов (метилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.д.) и 3) экспрессия некодирующих РНК. Самыми изученными (и, предположительно, самыми важными в контексте эпигенетической регуляции) среди этих процессов являются метилирование и ацетилирование. Первый процесс подразумевает добавление метильной группы (СН3), чаще к цитозину в составе CpG-динуклеотида, что блокирует экспрессию генов путем предотвращения развинчивания ДНК с гистонов и вмешиваясь в работу ферментов, участвующих в транскрипции. В промоторах большинства генов находятся так называемые CpG островки, а их метилирование обуславливает отсутствие экспрессии соответствующего гена. Ацетилирование гистонов стимулирует экспрессию генов путем добавления ацетил группы (СН3СО) к гистоновым белкам и развинчивания ДНК с гистонов, деацетилирование  — ингибирует за счет обратного процесса, что обусловлено притягиванием отрицательно заряженной молекулы ДНК к положительно-заряженным деацетилированным лизиновым остатков гистонов. Модификации гистонов осуществляются с помощью ферментов: добавлением метильной и ацетил групп занимаются метил- и ацетилтрансферазы (HATs) соответственно, а удалением —  лизин-деметилазы и деацетилазы гистонов (HDACs). Некоторые из многим известных в контексте старения белков сиртуинов как раз относятся к классу III HDACs, которые, в отличие от других HDACs, зависят от NAD+ (подробнее про эту молекулу в отделе про митохондрии) для деацетилирования. 

Изменения в метилировании ДНК (статуса метилирования определенных CpGs), наблюдаемые с возрастом, легли в основу известных эпигенетических часов (оригинальная версия известна как часы Хорвата в честь ученого, их разработавшего в 2013 году, и основана на паттерне метилирования 353 участков CpGs), позволяющих достаточно точно определять возраст любой ткани и использующихся как биомаркер старения. С возрастом наблюдается гиперметилирование 193 CpGs участков и гипометилирование остальных 160. В целом же старение характеризуется глобальным гипометилированием генома, в то время как промоторы определенных генов гиперметилируются. 

Применение часов Хорвата показало, что большинство тканей и органов тела человека стареют с одинаковой скоростью несмотря на разную пролиферативную и регенеративную способность клеток разных типов. Однако, есть и исключения, например, ткань молочных желез женщин эпигенетически старше других частей тела, а к клеткам спермы эпигенетические часы не применимы (эпигенетический возраст спермы намного ниже хронологического, однако, возможно разработать эпигенетические часы специально для спермы). Еще одной интересной чертой эпичасов является возможность их применения для разных животных (шимпанзе, собакам, а Стив Хорват работает над созданием универсальных часов для позвоночных). Способность эпигенетических часов достаточно точно определять возраст, а  также семейная кластеризация паттернов метилирования говорит о генетической заданности эпигенетических изменений, происходящих с возрастом. В то же время факторы окружающей среды (диета, физические упражнения, UV облучение и т.д.) также влияют на эпигенетический статус индивидуума, как показывают в том числе исследования на однояйцевых близнецах. Интересно, что долгожители, также как и их потомки, демонстрируют более молодой эпигенетический профайл по сравнению с ожидаемым. В этом контексте важно, что эпигенетические часы точно коррелируют со смертностью, т.е., определив биологический возраст по паттерну метилирования, можно предсказать риск смерти, подробнее в статье Юрия Дейгина здесь. А в этой статье можно прочитать про то, в каких конкретно генах наблюдается разница метилирования в молодом и пожилом возрасте, разных эпичасах (до и после часов Хорвата 2013 года). Автор придерживается одного из двух господствующих в настоящее время в научном мире взглядов на старение, состоящего в том, что это программа, реализуемая через эпигенетические изменения, и излагает аргументы в поддержку этого. Адепты данного подхода надеются найти источник управления такой программой и вмешаться в его работу с целью обратить старение вспять. Одним их таких инструментов считается “эпигенетический откат”. Однако, известен и другой взгляд на старение как на продукт накопления патологических стохастических изменений. Сторонники этого подхода указывают на неточность эпичасов, сильный разброс при их применении для оценки возраста разных тканей и органов, и подчеркивают их вероятную бесполезность в связи с тем, что они точно предсказывают лишь хронологический возраст, подробнее в серии статей Александра Фединцева здесь.  

Что касается гистонов, то с возрастом наблюдаются изменения в их модификации и пониженный уровень экспрессии этих белков у различных видов животных. А стресс, вызванный сокращением уровня гистонов с возрастом, получил название архитектурный дефект хроматина (chromatin architectural defect – CAD). Подразумевается, что возраст-ассоциированные нарушения в организации и экспрессии гистонов приводят к дисрегуляции экспрессии других генов (ведь, как мы уже пояснили, экспрессия генов сильно зависит от упаковки ДНК — “намотки” на гистоны). Примечательно, что уровень экспрессии гистонов понижен в сенесцентных клетках. Существуют и другие связи между возраст-ассоциированными эпигенетическими измененими и остальными процессами, лежащими в основе старения. Например, воспаление, вызванное повышенной концентрацией активных форм кислорода (ROS), вызывает поломки ДНК, что приводит к более частым мутациям и нарушает ДНК метилирование. Напомним, что ROS производятся в результате работы митохондрий, а эпигенетические изменения, вызванные ROS, в свою очередь, могут влиять на экспрессию генов, необходимых для работы митохондрий. В целом, логично предположить, что эпигенетические изменения, наблюдаемые с возрастом, могут вызвать любого рода нарушения в работе клеток и организма, ведь они диктуют активность генов. Однако, для доказательства того, что именно они являются драйвером старения необходимы экспериментальные данные, показывающие, что отмена подобных изменений существенно продлит жизнь или омолодит организм. Обсудим успех таких исследований в следующем разделе.

Некодирующие РНК (ncRNAs) — класс эпигенетических регуляторов, изучение которых только набирает обороты. Ранее считалось, что часть ДНК, не кодирующая белки (а это подавляющая её часть) — своего рода мусор, ведь функциональными кирпичиками являются именно белки. Однако, всё больше данных накапливается о важности различных видов некодирующих РНК в регуляции экспрессии генов. В частности это касается микроРНК (miRNAs), малых интерферирующих РНК (siRNAs) и piРНК (piRNAs), которые регулируют экспрессию генов, запуская программу деградации матричных РНК или нарушая трансляцию. Напомним, что путь PIWI-piРНК, комплекс белков семейства PIWI и piРНК является важной стратегией подавления транспозиции, подробнее здесь. Также активно ведутся исследования длинных некодирующих РНК (lncRNAs) и их роли в старении, в том числе выделении lncRNAs, играющих роль в поддержании молодости клеток. Сравнительные исследования, описывающие изменение экспрессии некодирующих РНК в клетках молодых и старых животных, а также пролиферирующих и сенесцентных клетках, помогли выделить целый ряд ncRNAs, как важных регуляторов старения. Так, TERC является некодирующей РНК и важным компонентом теломеразы, а, как известно, укорочение теломер — один из триггеров сенесценции, в то время, как повышенная экспрессия теломеразы исследуется как потенциальный анти-эйджинговый способ. 

Методы борьбы и состояние на данный момент 

Временный эпигенетический откат (репрограммирование) — исследования на животных

Пожалуй, одним из самых известных на данный момент ученых, исследующих эпигенетику в контексте старения и активно продвигающих идею о том, что потеря идентичности клеток из-за эпигенетических изменений — первопричина старения, является Дэвид Синклер, выпустивший совсем недавно книгу Lifespan на эту тему. Синклер — профессор Гарвардской Медицинской Школы, его лаборатория занимается изучением сиртуинов и всего, что с ними связано в контексте эпигенетики и старения. В июле 2019 года Синклер с коллегами опубликовали препринт статьи с результатами исследования по эпигенетическому перепрограммированию клеток глаза мышей с помощью трех факторов Яманаки, Oct4, Sox2 и Klf4 – OSK в отсутствии c-Myc в виду способности этого онкогена сокращать ПЖ. Как мы уже упомянули, факторы Яманаки способны дедифференцировать клетки, превращая их в плюрипотентные стволовые. Однако, в целях омоложения полный эпигенетический откат неприемлем, поскольку ведет к последующему высокому риску образования тератом. В своем исследовании ученым удалось успешно опробовать периодическую экспрессию OSK in vivo на мышах с помощью вирусного вектора AAV: было скорректировано возраст-ассоциированное изменение в паттерне метилирования ДНК, вызванное травмой оптического нерва, а также восстановлено зрение мышам с возраст-ассоциированной слепотой.  

Несколько месяцами ранее же был опубликован препринт статьи с результатами исследования, проведенного командой трех основателей компании Turn.bio, в котором они применили технологию эпигенетического репрограммирования старения (ERA) с помощью временной экспрессии матричных РНК (mRNA) коктейля факторов: mRNA экспрессирующих OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 и NANOG (OSKMLN). Предположительно, использование mRNA факторов вместо самих белков позволяет исследователям более тонко контролировать перепрограммирование. Эксперимент был проведен на фибробластах и эндотелиальных клетках, взятых у пожилых людей в возрасте 60-70 лет и 45-50 лет соответственно. На старых человеческих стволовых клетках мышц было также показано, что метод ERA их омолаживает и восстанавливает их функциональность, что может стать методом лечения саркопении.  

В феврале 2020 года были опубликованы результаты экспериментов компании AgeX Therapeutics по перепрограммированию клеток супердолгожителя возрастом 114 лет. Напомним, что Фокусом AgeX является разработка методов борьбы с ВЗЗ на основе применения плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и перепрограммирования старых клеток для их омоложения. Компанию возглавляют Майкл Д. Уэст, эксперт по технологиям связанных со стволовыми клетками человека, и Обри де Грей, сооснователь SENS Research Foundation. В ходе эксперимента исследователи AgeX перепрограммировали В-лимфоциты супердолгожителя, 43-летнего человека (контроль) и 8-годовалого пациента с прогерией в iPSC в помощью коктейля OKSM (Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc) и сравнили способность этих клеток образовывать тератомы (в подтверждение их плюрипотентности), дифференцировать (в клетки 3-х эмбриональных слоев), а также оценили скорость сокращения теломер в клетках до и после перепрограммирования. Было показано, что клетки как супердолгожителей так и пациентов с прогерией можно также эффективно перепрограммировать как и клетки здоровых людей, используя, OKSM. Однако, несмотря на восстановление длины теломер клеток контроля и пациента с прогерией после перепрограммирования до длины эмбриональных стволовых клеток, клетки супердолгожителя не показали такого же последовательного результата (только в 1 из 3 линий).Транскриптомный анализ показал, что iPSC, полученные из клеток как супер долгожителя так и в модели ускоренного старения, не отличаются от iPSC, полученные из клеток контроля. Таким образом, по-видимому, эпигенетический откат возможно осуществить в клетках человека любого возраста. Осталось лишь подтвердить успешность подхода in vivo и на разных клетках человека.    

Еще одной организацией, проводящей эксперименты по эпигенетическому откату и сотрудничающей с ведущими по данной тематике лабораториями, является Youthereum Genetics во главе с ранее упомянутым Юрием Дейгиным. Идеей Youthereum является попытка найти безопасное временнОе “окно” репрограммирования клеток, попадание в которое не несло бы риска перерождения клеток в онкологические, и применение только Oct4 в рамках этого окна как инициирующего фактора эпиотката. Подробное описание эксперимента здесь и здесь. Интересно, что при условии успешных исследований на культуре клеток и мышах в планы компании входит создание генетически-модифицированных домашних животных со встроенной кассетой “омолаживающих” генов, которые можно будет активировать хозяевам, например, с помощью применения тетрациклина.  

Одной из проблем осуществления эпиотката, в случае если его осуществление окажется возможным на клеточных культурах, является доставка омолаживающих факторов. Критическим является перепрограммирование большего количества клеток для омоложения всего организма, поскольку доставка векторов генной терапии во все виды клеток является нерешенной проблемой. Это самостоятельная задача, решение которой необходимо для лечения многих генетических заболеваний, и над ней, несомненно, работают разные научные группы, поэтому есть определенные основания для оптимистичных ожиданий.

Сокращение потребляемых калорий (CR) — пилотные клинические исследования

На многочисленных модельных организмах, в том числе — приматах, было показано, что ограничение калорий (CR) увеличивает не только ПЖ, но и здоровую ПЖ. Вероятно, по крайней мере отчасти это связано с защитным эффектом CR от возраст-ассоциированных изменений в метилировании ДНК. Эпигенетически мыши и макаки на диете CR моложе своего хронологического возраста. СR в первую очередь увеличивает экспрессию некоторых сиртуинов, а их активаторы способны имитировать эффект CR, откладывая признаки старения и увеличивая ПЖ мышей с ожирением. Краткосрочные исследования влияния CR на людях (CALERIE, включая вторую фазу на здоровых людях без ожирения, число участников — 53, возраст — от 21 до 50 лет, длительность — 2 года) показали благоприятное воздействие сокращения калорий: были отмечены пониженный оксидативный стресс и воспаление, а также замедление метаболизма. Однако, неясно, является ли это результатом воздействия на эпигенетические изменения, плюс небольшая выборка не позволяет сделать окончательные выводы о пользе CR. 

Сокращение калорий регулирует эпигенетические сигнальные пути. Источник: Zhang, W., Qu, J., Liu, G.-H. & Belmonte, J. C. I. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2020) doi:10.1038/s41580-019-0204-5

Фармацевтические препараты — клинические исследования

Несмотря на то, что на данный момент нет препаратов специально разработанных для замедления или поворота вспять возраст-ассоциированных эпигенетических изменений, существует ряд фармацевтиков, доступных на рынке, которые потенциально могут омолодить организм, воздействуя на те или иные механизмы регуляции экспрессии генов. Среди них:

Рапамицин — иммуносупрессор, ингибитор сигнального пути mTOR, недавно показавший успех в пилотном исследовании на людях как анти-эйджинговый препарат для омоложения кожи. Его применение имитирует эффект CR путем воздействия на mTOR, а на мышах была показана способность рапамицина замедлять накопление возраст-ассоциированных эпигенетических меток.

Метформин — противодиабетический препарат, который модулирует активность AMPK, регулирующую многочисленные эпигенетические ферменты. Метформин уже давно зарекомендовал себя как один из потенциальных анти-эйджинговых препаратов, особенно после исследований, показавших, что диабетики, принимающие его, прожили дольше, чем люди такого же возраста без диабета и, соответственно, не принимающие препарат. Однако, дополнительные исследования показывают, что метформин может нивелировать положительный эффект физических упражнений, а, вероятно, регулярная физическая нагрузка — лучший способ продлить ПЖ, чем прием метформина. Важно, что в конце 2019 наконец-то удалось запустить клиническое исследование по оценке эффективности метформина именно как анти-эйджингового препарата (исследование известно под названием TAME — Targeting Aging with Metformin). В рамках исследования планируется в том числе оценить изменение транскриптома после применения препарата. А, значит, можно будет делать выводы об изменения в регуляции экспрессии генов, вызванных метформином.    

Кверцетин — было показано, что этот известный своими сенолитическими свойствами флавоноид, находящийся на стадии клинических исследований в комбинации с дазатинибом, регулирует активность ферментов эпигенетической регуляции, а также способен восстанавливать структуру гетерохроматина старых клеток.

NAD+ или его предшественники — учитывая, что активность сиртуинов зависит от NAD+, важными являются результаты многочисленных исследования на животных и пилотных клинических исследований по оценке эффективности применения предшественников NAD+ (например, никотинамид рибозида (NR)) как анти-эйджингового препарата. Несмотря на успешные результаты применения добавок в исследованиях на грызунах и факт того, что уровень NAD+ с возрастом падает, на данный момент нет убедительных подтверждений тому, что прием предшественников NAD+ поможет откатить возраст-зависимые эпигенетические изменения. Более того, есть данные о стимуляции сенесценции путем повышения уровня NAD+. Как мы писали здесь, сенесценция, вероятно, является причиной пониженного NAD+, а применение сенолитиков может оказаться единственной необходимой мерой как для удаления сенесцентных клеток, так и восстановления концентрации NAD+ без дополнительного приема его предшественников. Опять же физические упражнения — наиболее верный и доступный способ увеличить концентрацию NAD+.  

Витамин С — существуют данные по результатам исследований на грызунах, показывающие, что витамин С способен восстанавливать структуру гетерохроматина и влиять на экспрессию генов, возможно, через эпигенетическую регуляцию.

Влияние на причины смерти

Учитывая накопленные данные о пагубном влиянии возраст-ассоциированных эпигенетических изменений на всевозможные клеточные процессы, предполагаем, что внедрение методов эпигенетического отката поможет бороться почти со всеми известными болезнями, ассоциированными со старением, тем самым снижая вероятность умереть от:

• Сердечно-сосудистых заболеваний
• Нейродегенерации
• Остеопороза
• Саркопении
• Диабета
• Онкозаболеваний
• Артрита
• Инфекций за счет снижения уровня хронического воспаления и улучшения функционирования иммунной системы.

Источники

https://advances.sciencemag.org/content/5/7/eaav1165

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4112140/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24138928

https://www.nature.com/articles/s41580-019-0204-5

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(06)00976-7

https://advances.sciencemag.org/content/5/7/eaav1165

https://academic.oup.com/nar/article/47/14/7294/5525056

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/829192v1

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/573386v1

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/710210v1.full

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5391218/

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-017-1203-5

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0047637418300186

https://jcs.biologists.org/content/132/8/jcs227801

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1568163715300362

https://papers.ssrn.com/sol3/papers.cfm?abstract_id=3466338

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1934590919304230?via%3Dihub

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22981898

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11357-019-00113-y

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4930768/

https://www.fightaging.org/archives/2019/09/tame-trial-for-the-effects-of-metformin-in-humans-to-proceed-this-year/

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/acel.12880

https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/0300060518817164

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/680462v1.full

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/680462v1.full

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31140365

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1550413119302554

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-019-0667-1

Автор обзора: Лариса Шелоухова

Перепечатка разрешается при сохранении ссылок на источник публикации